대중적으로 사용하는 PCR
증폭이 모두 끝나고 나면 DNA가 제대로 증폭되었는지 확인하여야 합니다. 이때 Agarose Gel 전기영동을 통해 증폭 여부를 확인할 수 있는 방법과 PCR이 running 되는 동안 실시간으로 DNA의 증폭을 확인할 수 있는 방법이 가장 많이 사용됩니다.
PCR이 running되는 동안 실시간으로 DNA의 증폭을 확인하는 PCR을 qPCR이라고도 하며 Real time PCR 혹은 RT-PCR이라고도 합니다. RT-PCR의 경우 Real-Time PCR이 아닌 RNA를 cDNA로 합성하여 PCR을 하는 Reverse-transcriptase PCR이라는 뜻으로도 사용되기도 합니다.
cDNA
PCR을 할때 Genome 상의 특정 영역을 얻고자 하는 경우 혹은 변이를 확인하려 할 때는 DNA를 추출해서 사용하고, expression 과정에서 확인할 것이 있을 때는 RNA를 추출해서 사용합니다.
단일가닥인 RNA를 추출하여 분석을 할 때는 RNA를 cDNA(mRNA로부터 역전사 된 DNA)로 합성하여 PCR을 하게 됩니다. cDNA를 사용하는 이유는 mRNA상의 특정한 sequence를 증폭하기 위해서입니다. mRNA는 intron이 제거된 coding sequence로 특정한 부분만 증폭시키는데 용이합니다.
그렇기 때문에 cDNA는 번역에 필요한 엑손만으로 이루어져있다는 특징이 있으며, 불안정한 RNA sample을 cDNA로 합성하면서 안정성이 생긴다는 장점도 가지고 있습니다.
Agarose Gel을 이용한 전기영동법
겔 전기영동(gel electrophoresis)
DNA나 RNA, 단백질과 같은 큰 분자들을 전기적인 힘을 이용하여 겔에서 이동시켜 크기에 따라 서로 분리하는 기술로 해상도는 낮지만 고분자를 200bp에서부터 50kb까지 분리할 수 있으며, 사용이 간편하고 다루기가 쉽기 때문에 겔 전기영동이 현재 가장 많이 사용하고 있습니다.
겔 전기영동은 겔에 전류를 흘려주어서 전하를 가진 입자가 겔 내부에서 이동하여 분리하며 DNA나 RNA의 경우 주로 아가로즈(agarose)를 사용합니다. 겔에 홈을 만들어 분석하고자 하는 분자를 집어넣고 전류를 흘려주면 음전하를 띤 분자들은 전기적인 힘에 의해 겔 안에서 이동하게 됩니다.
DNA는 deoxyribose가 인산 ester결합을 하기 때문에 phosphate group에 의해 (-)charge를 가지게 됩니다. (-)는 두 전극 사이에 위치했을 때 (+) 극 쪽으로 움직여 이동하게 되는 원리입니다.
같은 크기를 가진 분자들은 하나의 집단을 형성하여 움직이며 만약 수조 개의 동일한 분자들을 전기영 동하였다면 겔을 염색하였을 때 이것이 하나의 띠 모양으로 나타나는 것을 확인할 수 있습니다.
Agarose gel 전기영동시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인
DNA 분자의 크기↑ ⇒ 이동속도↓
Agarose의 농도↑ ⇒ 이동속도↓
부하되는 전압↑ ⇒ 이동속도↑
**전기장의 방향, 전기영동의 완충용액의 성분, 이온의 세기도 이동속도에 영향을 줍니다.
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