계대배양 (Cell culture) 준비(1)

처음 세포를 다루기 시작할 때 무엇을 준비해야 할지, 어떤 부분을 조심해야 할지, 잘 모르는 경우가 대다수입니다.

모든 게 어색할 학부생들과 대학원을 시작하는 친구들에게 도움이 되고자, 그리고 나에게 도움이 되고자 제가 공부했던 내용들을 기록할 예정입니다.

계대 배양 준비 (prepare of cell culture)

 

• 생물안전 작업대 (BSC, Biological safety cabinet) 혹은 클린벤치(Clean bench)
• 항온수조(Water bath)
• 혈구 계산기(Hamocytometer)
• 인큐베이터(Incubator)
• 도립현미경
• 세포 배양용 배지 (DMEM, RPMI, MEM 등)
• 세포 배양용 혈청 (FBS, BCS 등)
• 항생제
• 세포 세척액(Wash buffer)
• Trypsin-EDTA
• Trypan blue
• 알코올램프 (optional)

 

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계대 배양에 들어가기에 앞서 준비할 장비와 용액들에 대해 자세히 알아보고자 합니다.

기본적으로 세포실험은 생물안전 작업대 (BSC, Biological safety cabinet) 혹은 클린벤치(Clean bench)에서 이루어집니다. 둘의 차이를 알아야 실험 목적에 맞는 장비를 사용할 수 있습니다.

 

생물안전 작업대(BSC, Biological safety cabinet)와 클린벤치(CB, Clean bench)

 

BSC와 CB는 주로 사용 목적에 따라 다르며,

내부 공기의 청정도, 규격, 풍향, 공기 순환 방식에 차이가 있습니다.

 

생물안전작업대(BSC, Biological safety cabinet)

생물안전작업대(BSC-Biological-safety-cabinet)

실험자를 내부 샘플인 시료(병원체)로부터 보호하여 오염을 방지하도록 설계된 것을 말합니다. 균이나 미생물을 취급하는데 용이하며 클린벤치보다 안전성이 보장된 장비입니다.

 

BSC의 공기는 필터를 통해 챔버 내부로 들어와 샘플에 의해 오염된 공기가 실험자가 있는 방향이 아닌 챔버 내부로 순환되어 필터를 통해 외부로 배출됩니다. 그렇기 때문에 사람에게 유해한 세균 또는 바이러스를 다루어야 할 때 사용하는 장비로 위험도에 따라 Class가 나누어져 있습니다.

 

https://microbenotes.com/biological-safety-cabinets-classes-examples/

Biological Safety Cabinets (BSCs)- Classes with Examples

 

클린벤치(CB, Clean bench)

클린벤치(CB-Clean-bench)

정식 명칭은 Laminar Flow Cabinet으로 작업대 내 공간을 깨끗한 공기로 채워 샘플인 시료나 제품 등이 오염(Contamination)되지 않도록 방지하기 위해 사용합니다. CB 내의 공기는 필터를 통해 챔버로 들어와 샘플에 의해 오염된 공기가 실험자가 있는 방향으로 흘러나오며 사람에게 해롭지 않은 세균 또는 바이러스를 다루는 장비입니다.

 

https://microbenotes.com/laminar-flow-hood/

Laminar flow hood/cabinet- Definition, parts, principle, types, uses

 

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항온수조(Water bath)

항온수조(Water-bath)

항온수조는 세포실험 전에 세포에 사용하는 용액들을 데우기 위해 사용합니다. 세포 배양에 적합한 온도는 37°C로 배양 전 미리 세팅해 둔 다음 사용합니다. 

 

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혈구 계산기(Hamocytometer)

혈구계산기(Hamocytometer)

혈구 계산기는 세포를 계대 배양할 때 세포를 계수하기 위해서 사용하는 장비입니다.

 

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인큐베이터(Incubator)

 

인큐베이터(Incubator)

인큐베이터의 온도는 세포 배양에 적합한 37°C로 세팅하고 인큐베이터 내 이산화탄소의 농도는 5%로 세팅합니다. 이산화탄소는 세포 생장에 영향이 없지만 CO2가 배양액에서 기화되어 나오는 것을 막기 위해 필요하며, 배양액의 pH를 조절하고 pH의 변화에 대비하여 배양액의 세포를 완충시키는 역할을 합니다.

배지 중 CO2가 외부 공기로 빠져나오지 않아야 세포대사의 정도를 파악하는 지시약의 색깔이 바뀌게 됩니다. 세포의 대사 정도에 따라 배양액의 pH가 변화하게 되는데 배지 중 CO2의 기화를 억제하기 위하여 인큐베이터 공기에 5%의 높은 농도의 CO2를 처리하게 됩니다.

CO2 농도 5%는 생리학적으로 치명적으로 높은 농도이지만 기체 분압 5%는 액상으로 용해되기엔 낮으며, 인큐베이터 내의 CO2 공급이 배지 안으로 녹아들어 가지 않고 배지 중의 용존 CO2 양이 외부로 빠져나가지 않는 적정한 분압이 5%이기 때문에 5%로 세팅하여 사용합니다.

결론적으로 인큐베이터 내 CO2의 공급은 세포 생육을 돕기 위한 것은 아니며 세포 생장을 모니터 하기 위한 것입니다.

 

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도립현미경

도립현미경

세포는 아주 작은 크기로 이루어져 있기 때문에 세포를 관찰하기 위해서는 현미경이 필수입니다. 여러 가지 종류의 현미경이 있지만 세포를 관찰할 때는 도립현미경을 사용합니다. 그 이유는 세포의 배양 방식에서 배양액 높이로 인해 정립 방식으로는 세포의 초점을 맞추는 것은 일반적으로 힘듭니다. 도립현미경은 dish나 well plate 배양의 경우 바닥에서 세포까지 거리의 초점을 맞추기가 비교적 쉽습니다. 슬라이드에 배양한 후 coverslip으로 관찰할 경우는 정립현미경으로도 충분히 가능합니다. 하지만 정립현미경으로 초점의 거리가 안 나오면 도립현미경으로 봐야 합니다.

 

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