PCR(Polymerase Chain Reaction)의 원리 (3)

PCR 진행 과정

 

PCR-진행-과정

 

PCR은 Cycle당 2n배로 DNA가 증폭됩니다. 이론상으로는 Cycle이 진행되는 횟수와 비례해서 2n배로 DNA가 증폭되어야 하는데 위의 그림을 보시면 어느 순간부터는 더 이상 DNA가 증폭되지 않고 saturation 됩니다.

 

이렇게 되는 이유는 다양합니다.

 

PCR-요소

 

PCR reaction tube에 더 이상 합성할 dNTP가 없거나, Polymerase의 활성이 떨어졌다거나, Primer를 다 써버려서 더 이상 DNA가 증폭되지 않게 되는 것입니다. 

 

이러한 이유 때문에 PCR 증폭 과정을 다음과 같이 3단계로 구분지을 수 있습니다. Exponential 구간은 초반에 Meterialmaterial들이 넉넉하고 모든 조건이 갖춰져 있기 때문에 증폭 효율이 매우 높습니다.

 

그러다 점점 PCR component들이 고갈되면서 반응 효율이 낮아지는 Linear 구간을 지나 결국 대부분의 component들이 소진되어서 더 이상 DNA가 증폭되지 않는 Plateau구간으로 진입하게 됩니다.

 

Real time PCR, qPCR (실시간 중합효소 연쇄반응)

 

qPCR은 어떻게 실시간으로 DNA의 증폭을 확인할 수 있을까요? 바로 Detection chemistry인 형광물질을 이용해서 확인하게 됩니다. Detection Chemistry는 크게 두 가지 방식으로 구분되는데, 형광 dye 방식과 probe 방식입니다.

 

Detection-chemistry

 

SYBR green

가장 많이 사용되는 형광 dye인 SYBR green은 그림처럼 DNA 이중나선에 결합하게 됩니다. SYBR green의 특징은 단독으로 있을 때는 형광을 발현하지 않지만, DNA의 double strand에 결합해 있을 때는 형광을 발현하게 됩니다.

 

그렇기 때문에 새로운 DNA가 합성될 때마다 reagent에 떠다니던 SYBR green이 사이사이 결합하게 됩니다. 즉, DNA가 합성되는 만큼 SYBR green의 형광 시그널이 커지게 됩니다. 이 형광 시그널을 실시간으로 측정하게 되면 PCR이 진행되는 동안 DNA가 얼마나 합성되었는지 알 수 있게 됩니다.

 

TaqMan probe

기본적으로 Taq Man probe는 Oligo와 염기서열로 이루어져 있습니다. 즉, primer처럼 증폭되는 염기서열에 붙을 수 있도록 design 됩니다. 5’ 쪽에는 reporter dye가, 3’ 쪽에는 Quencher dye가 있습니다.

 

여기서 Reporter dye는 DNA의 증폭 정도를 알려주는 형광 Dye이며, Quencher dye는 Reporter dye의 형광을 억제시키는 dye입니다. 그래서 이 두 개의 dye가 붙어있을 때에는 Quencher가 Reporter dye의 형광을 억제시켜서 형광 발현을 안 하며, 이 둘이 떨어져 있게 되면, Reporter dye가 형광을 나타내게 됩니다.

 

PCR이 시작되면 새로운 DNA를 합성하기 위해 denaturation 된 single strand DNA에 Primer가 붙고, 이 DNA 염기서열에 맞게 제작된 TaqMan probe가 붙게 됩니다. Binding 된 primer를 통해 5’에서 3’ 방향으로 새로운 DNA 가닥이 합성되면서 TaqMan Probe가 있는 곳까지 가게 되면 중합효소의 5’ Exonuclease activity에 의해 Probe가 가수분해 됩니다. 그 과정에서 Reporter dye가 떨어져 나가게 되면서 형광이 발현됩니다.

 

DNA 1개가 합성되면 reporter dye 하나가 형광 시그널을 갖게 되며 이 형광 시그널을 실시간으로 측정해서 DNA의 증폭량을 확인할 수 있는 원리입니다.

 

비교

Probe 방식과 Dye 방식을 비교해보면, Probe 방식이 Target DNA에 특이적으로 binding 해서 시그널을 나타내는 것에 반해 Dye는 DNA의 이중나선에 무작위로 binding 하여 시그널을 나타내기 때문에 probe 방식이 specificity가 높고 정확한 장점이 있습니다. 다만 probe의 경우 target DNA의 염기서열에 맞춰 제작해서 사용해야 한다는 불편함이 있습니다.

 

Real time PCR, qPCR (실시간 중합효소 연쇄반응) 결과 분석

 

Real-time-PCR-결과

 

이렇게 qPCR이 완료되면 위와 같은 graph를 얻게 되면 증폭 효율이 좋은 PCR Exponential 구간에서 가상의 선 Threshold를 그립니다. Y축이 DNA의 양을 의미하기 때문에 이 Threshold에서 모든 sample의 DNA 양은 같게 됩니다.

 

그래서 이 Threshold에 얼마나 빨리 도달하느냐를 통해 sample 내 Target DNA의 양을 확인할 수 있습니다. 이 threshold에 일찍 도달하는 앞쪽 sample은 PCR cycle이 몇 번 반복되지 않고도 기준 DNA양에 도달했기 때문에 DNA 양이 상대적으로 많다는 것을 의미하며  DNA의 양이 적을수록 더 많은 PCR cycle이 진행된 후 Threshold에 도달하게 됩니다.

 

DNA가 Threshold에 도달하는 지점, 이때의 cycle 수를 Threshold cycle이라 하고 Ct값이라고 표현합니다. 이 Ct값을 통해 sample 내 Target DNA양을 알 수 있습니다.

 

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