계대배양 하기 (Cell culture)

2022.12.01 - [실험] - 계대배양 (Cell culture) 준비(1)

계대배양 (Cell culture) 준비(1)

2022.12.02 - [실험] - 계대배양 (Cell culture) 준비(2)

계대배양 (Cell culture) 준비(2)

실험 준비 

• 실험에 필요한 배양 배지, T/E, PBS 혹은 DPBS(이하 PBS)를 37°C 항온수조에서 데워줍니다(약 20분).
• 실험 전 장갑 낀 손을 알코올을 이용해 소독합니다. 
• BSC(생물 안전 작업대) 혹은 CB(클린벤치)를(이하 BSC) 켜고 그 내부를 70% 알코올로 닦아 소독해줍니다.
• 데워진 배양 배지, T/E, PBS의 물기를 제거한 후 각각 알코올을 뿌린 다음  BSC 안으로 넣어줍니다.
• (optional) 알코올램프를 이용해 BSC 안으로 넣어준 배양 배지, T/E, PBS의 뚜껑과 입구를 화염 멸균합니다.

 

실험 방법

• 이산화탄소 배양기에서 세포가 배양된 플라스크 혹은 디쉬를(이하 플라스크) 꺼냅니다.
• 도립 현미경을 이용하여 세포를 관찰합니다.
• 세포가 80% 이상 자랐다고 판단되면 계대 배양을 진행합니다.
• 세포가 배양된 플라스크를 BSC 안으로 넣습니다.

**실험할 때 모든 용액은 세포에 직접 분사하지 않으며, 세포가 부착되어 있지 않은 바닥면 혹은 옆면에 분사하여야 합니다.

• 세포 배양 플라스크 안의 배양 배지를 파이펫 에이드 혹은 석션기를 이용하여 제거해줍니다. 
• 75T 플라스크 기준 7~10mL, 100∅ 디쉬 기준 3~5mL의 PBS를 이용하여 남아 있는 배양 배지를 한번 더 제거해 줍니다.(필요에 따라 2번 반복합니다)
• 세척된 플라스크에 적정량의 T/E를(실험실, Cell line마다 다릅니다) 가한 후 세포가 플라스크로부터 분리될 때까지 이산화탄소 배양기 안에 넣어 줍니다.
• 일정의 시간이 지난 후 꺼내어 도립현미경을 이용하여 세포가 떨어진 것을 확인합니다.
• 플라스크를 BSC로 다시 가져와 Tube에 세포를 모읍니다. 
• 일정량의 배양 배지를 플라스크에 가하여 플라스크에 남아있는 세포들을 한번 더 튜브에 모아줍니다.
• 세포 실험실에 세팅되어있는 원심분리기를 이용하여 세포를 가라앉혀 줍니다. (대개 1200~2000 rpm, 3분~5분)
• 모아진 세포의 상층액은 버리고 세포만 남깁니다.
• 튜브를 살살 Tapping 하여 1차적으로 세포를 풀어줍니다.
• 세포 양에 따라 배양 배지의 양을(약 2~10mL) 조절하여 넣어 준 후 파이펫 에이드 혹은 마이크로 파이펫을 이용하여 Single  cell로 풀어줍니다.
• 아래에 링크된 세포 수 계수 및 세포 생존율 측정에 따라 다 풀어진 세포를 계수합니다.

 

2022.12.05 - [실험] - 세포 수 계수 및 세포 생존율 측정

세포 생존율 측정

 

• 계수된 세포를 알맞은 농도에 따라 새로운 플라스크에 배양해 줍니다.
• 날짜, Cell line, Passage No., 등 필요한 정보를 플라스크에 적은 후 이산화탄소 배양기에서 배양합니다.